摘要
本试验主要是对坚强芽孢杆菌代谢产物的产生条件，抗菌机制，抗菌成分进行了较为深入的探索。
1、本试验对培养基和生长条件的研究可以看出：将CM，NYDA，LB，NB，J式培养基做为基础培养基进行第一次筛选后，通过生物测定显示，NB培养基可以作为最优基础培养基；然后在此基础上，通过摇瓶正交试验分析了不同碳、氮源以及温度、pH、溶氧量对坚强芽孢杆菌产代谢产物影响的显著性差异，最终确定了最佳培养基配方和最优生长条件为牛肉膏8g，蛋白胨10g，葡萄糖14g；最优生长条件为PH值7.5，溶氧量取150 ml培养液于300 ml三角瓶中振荡培养，最适温度为35℃。经最优培养基培养Bacillius firmus后分离到的无菌代谢产物对指示菌的抑菌率达到79％以上，且在病原菌培养时间内不产生分生孢子。通过对生长曲线和代谢产物抗菌活性曲线的测定结果表明，在培养60小时时，坚强芽孢杆菌的菌量和代谢产物的抗菌活性达到最大；一般来说，培养时间不能超过72小时，因为此时无论是菌量的多少或是代谢产物的产出都开始进入衰退期，不利于代谢产物的提取与利用。
2、通过抗菌代谢产物对指示菌枯斑拟盘多毛孢菌丝与分生孢子的作用可以看出，该抗菌物质的作用机制主要是以溶菌和拈抗作用为主。试验结果显示，该代谢产物可以使病原菌菌丝颜色加深，壁加厚，菌丝隔膜增加，每一段形状变为念珠状或椭圆形，以菌丝分枝变形最为严重，大多数膨大为囊状，内部形成球状颗粒，甚至破碎、裂解，内部原生质溢出，使菌丝变为空壳。使病原菌的分生孢子不萌发，胞壁明显变薄，特别是萌发胞，首先是开始膨大，细胞壁较其他两节细胞薄，然后完全变成泡囊状；有些分生孢子的第一节细胞也同时膨大为泡囊状，细胞壁很薄；在代谢产物处理48小时后，分生孢子的萌发胞普遍破裂，第一节细胞壁也陆续裂解，内部原生质外溢。抗菌谱的试验结果表明，坚强芽孢杆菌的抗菌代谢产物具有广谱高效的抗菌作用，针对各种各样的病原真菌都有很明显的抑制作用。除了对接合菌亚门的总状毛霉没有抗菌活性以外，对所有应试病原菌都显示出一定的抗菌活性。其中，对子囊菌亚门的核盘菌抗菌效果最佳，病原菌在含药平板上完全不生长；对半知菌亚门的桂花烂皮菌抑菌效果最差，但是抑菌率也达到了40％以上。
3、试验通过硫酸铵分级沉淀法，透析法，离子交换层析法，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺疑胶电泳(SDS-PAGE)对抗菌代谢产物的基本性质和分子量做了深入探索。试验结果显示，代谢物质在不同饱和度的硫酸铵作用下，都会不同程度的产生沉淀，沉淀比重较小，漂浮于液面，棕色，随着硫酸铵饱和度越大，得到的蛋白质抗菌活性和蛋白质含量同时增大，但是当硫酸铵饱和度到达70％时，抗菌活性与蛋白质含量到达顶峰。该沉淀物质经透析后仍然具有抗菌活性，对紫外线和氯仿基本稳定，对高温和酸的耐受性不强，对胰蛋白酶不敏感，对蛋白酶K部分敏感。以离子交换层析后分离出三个峰的样品，通过生物测定确定仅有一个峰的样品具有抗菌活性，SDS-PAGE后，结果表明只有具有生物活性的样品产生了一条清晰的谱带，但颜色较Marker淡。经过将谱带的位置与Protein Marker，middle所形成的谱带对比后可确定该蛋白的分子量为29kD左右。
the research was in order to deeply explore the producing condition, the inhibitory mechanism.the inhibitory component of metabolic products produced by Bacillius firmus.
1. The research is about the inhibitory culture medium and growth condition. From thebiology determine, the NB culture medium is confirmed as the best culture medium. Then thebest culture condition was determined by orthogonality test. It contains different carbon,nitrogen, temperature, pH, and oxygen, which is 8 g of beef extract, 10 g of peptone, 14 g ofglucose, pH7.5, 150 ml culture liquid shaky cultivate in 300 ml triangle bottle, and the fittesttemperature is 35℃. It is showed that the inhibitory rate is above 79% by metabolic productsof Bacillius firmus growed on the best culture condition, and no conidiophore had beenproduced. Otherwise, the upgrowth curve of Bacillius firmus and the inhibitory activity curveof metabolic products has been mensurated. It was infested that the highest quantity ofBacillius firmus and the best inhibitory activity was appeared at 60 hours cultivate. Generally,the cnltivate time conldn't over 72 hours, or else, both the quantity of Bacillius firmus and theinhibitory activity were turn into wane. It would make against on distilling and utilizing.
2. The researches in this part were about the inhibitory mechanism and extension of metabolicproducts. The inhibitory mechanism is dissolution and counteraction. Which were confirmedby the effect of metabolic products to the mycelium and conidiophore of Pestalotiopsisfunerea. The color of mycelium turn dark and the wall was turn thick. The septum ofmycelium increased, and each section turn to ellipse. The hardest one was divarication, themost of which was conglobate, contains roundness grain in it, indeed broken, and thebioplasm spill over. Some mycelium has been ruptured, cracked, and turned abnormality, thebioplasm spilled empty. The mycelium of Pestalotiopsis funerea couldn't born fromconidiophore. The cell wall of conidiophore has been turned thin in evidence, especially forthe first cell, which has been turn big, the wall was thiner than the other two cell's, indeedturn like a purse. The third cell of conidiophore has been turned like a purse at the same timepartly. After 48 hours, the third cell or the first cell of conidiophore have been broken, the bioplasm was spilled over. The study on the inhibitory range was indicated that, the range ofthe inhibitory effect by metabolic products, which produced by Bacillius firmus. It manifestedthat the metabolic products has obvious inhibitory effect to kinds of pathogeny, except Mucorracemonus. The best effect was to Sclerotinia sclerotiorum, it makes fungus couldn't grow.The wrost was to sweet-scented osmanthus husk festered fungus, but the inhibitory rate wasalso above 40%.
3. The researches was progressed on depositing gradely by vitriol ammonium, dialysis,Anion-exchange Chromatography, SDS-PAGE. The aim is to make sure the character andmolecular weight of its metabolic products. It was obvious that, the metabolic products woulddeposit in the different saturation of vitriol ammonium, and the more vitriol ammonium, themore deposit. The brown deposit float on the water, when the saturation of vitriol ammoniumarrived at 70%, both the inhibitory activity and the quantity of protein reach the crest. Thedialyzed deposit also have inhibitory activity, and it was steady in ultraviolet radiation,chloroform and trypsin, but not totally steady in high temperature, acid, and proteinase K.After Anion-exchange Chromatography, three kinds of sample has been collected, but only asample has inhibitory activity. Both of them were made use of SDS-PAGE. It was ascertainedthat the sample which has inhibitory activity bring a clear cincture, although the cincturewasn't clear, the molecular weight could be confirmed to 29KD more or less contrastd withprotein marker.
引文
[1] Baker K F. Evolving concepts of biological control of plant pathogens[J]. Ann. Rev. Phytopathol., 1987, 25:67～85
[2] 陆庆光．50年来中国生物防治回顾[J]_世界农业，1999，(9)：19～21
[3] 程序，曾晓光，王尔大．可持续农业导论[M]．北京：中国农业出版社，1997：35
[4] 彭好文，黎起秦，林纬．生物防治研究及其应用概况[J]．广西农业生物科学，2004，23(2)：170～174
[5] 黄红．生物防治——一条可持续农业发展的道路[J]．贵州师范大学学报(自然科学版)，2001．19(1)：40～41
[6] Greathead, D. J. Bulletin of the Royal Entomological Society[J]. 1994, 18(4):181～199
[7] 万方浩，叶正楚，郭建英等．我国生物防治研究进展及展望[J]．昆虫知识，2000，2(37)：69～73
[8] National Academy of Science. Report of the Research of Briefing Panel on Biological Control in Managed Ecosystem[J]. National Academy Press, 1998:265
[9] Nordlund, D. A. Biocontrol News and Information[J]. 1996, 17(2):35～44
[10] 鲁海菊，张云霞，刘云龙．生物防治研究进展[J]．红河学院学报，2004，2(2)：90～92
[11] 魏东晨，陈合志，李小朋等．生物防治森林病虫害的发展趋势[J]．中国林业，2004(1)：34
[12] CHET. T. Mycoparasitism-recognition, New Direction in Biological Contrl: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases[J]. physiology and ecology, 1999:725～733
[13] 张兴，马志卿，李广泽．生物农药评述[J]．西北农林科技大学学报，2002，30(2)：142～148
[14] 郑京．绿色农药发展概述[J]．安徽化工，2004，(3)：3～4
[15] 张丽萍，张贵云．微生物农药研究进展[J]．北京农业科学，2000，18(4)：22～24
[16] HOWELL C. R. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases:The history and evolution of current concept[J]. Plant Disease, 2003, 87(1):4～11
[17] DELRIO L. E. Biological control of sclerotinia stem of soybean with Sporidersmium sclerotivorurn[J]. Plant Disease, 2002, 86(9):999～1005
[18] WILSON M. Biological control of bacterial speck of tomato under field conditions at several location in North America[J]. Phytopathology, 2002, 92(12):1284～1293
[17] 胡霞，苑艳辉，姚卫容等．微生物农药发展概况[J]．农药，2005，44(2)：49～52
[18] 刘长令．植物保护中的天然产物[M]．农药译丛，1995，17(2)：25～28
[19] 邱德文．微生物蛋白农药研究进展[J]．中国生物防治，2004，20(2)：91～94
[20] 沈寅初，张一宾．生物农药[M]．化学工业出版社，2000：24
[21] MARTIN F. N. Biological approaches for control of root pathogens of straw berry[J]. Phytopathology, 2002, 92(12):1356～1363
[22] 周传恩．我国杀虫微生物的应用研究进展及发展前景[J]．农药，2001，40(7)：8～10
[23] 徐汉虹，安玉兴．生物农药的发展动态与趋势展望[J]．农药科学与管理，2001，22(1)：32～34
[24] 吴文伟，何成兴，罗雁婕．国内外生物农药的研究开发进展及发展前景[J]．云南农业科技，2003(增刊)：167～170
[25] 杨佐忠．桔草杆菌拮抗体在植物病害生物防治中的应用[J]．四川林业科技，2001，22(3)：41～44
[26] 于淑池，张利平，王立安．拮抗细菌作为生物防治手段研究进展[J]．河北农业科学，2004，8(1)：62～64
[27] 杨保伟，邱学礼，薛泉宏．9株芽孢杆菌的初步分离鉴定与拮抗性试验[J]．西北农林科技大学学报(自然科学版)，2004，32(7)：93～96
[28] 陈顺，徐国华，张翠霞等．蜡状芽孢杆菌LW9809芽孢生成条件及发酵代谢产物研究[J]．微生物学杂志，2004，24(3)：60～61
[29] 刘勇，张恩平，龚月生．蜡样芽孢杆菌分泌超氧化物歧化酶特性的研究[J]．饲料工业，2004，25(4)：46～48
[30] Eric R, Catherine D, Assia Z, et al. Characterization of aerobic and anaerobic vegetative growth of the food-borne pathogen Bacillus cereus F4430/73 strain[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2005, 2(51):149～159
[31] 李卫芬，陆平，周绪霞，多粘芽孢杆菌(?)-葡聚糖酶特性及其基因克隆[J]，浙江大学学报(农业与生命科学版)，2004．30(3)：331～335
[32] 张云峰，李有志，莫天砚．嗜热蛋白酶生产菌Bacillus sp．DPE7的产酶条件研究[J]．广西大学学报(自然科学版)，2004，29(3)：231～235，
[33] 傅海燕，曾光明，黄国和等．发酵培养法筛选堆肥中产表面活性物质的菌种[J]．环境科学与技术，2004，27(6)：68～70
[34] 袁小平，姚惠源．桔草芽孢杆菌内切木聚糖酶的分离纯化与鉴定．生物技术，2004，14(5)：54～55
[35] 倪丽娜．株高产黑色素细菌的分离及鉴定[J]．微生物学通报，2004，31(1)：55～59
[36] Cavaglieri L., Orlando J., Rodriguez M. I., et al. Biocontrol of Bacillus subtilis against Fusarium verticillioides in vitro and at the maize root level [J]. Research in Microbiology, 2005, 156(5/6): 748～754
[37] Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions[J]. Molecular Microbiology, 2005, 56(4): 845～857
[38] Monica L E, Elizabeth A D J, William E B J, et al. Viability and stability of biological control agents on cotton and snap bean seeds[J]. Pest. Manag. Sci., 2001, 57(8): 695～706
[39] 廖咏梅，张梓英，黄定安等．甘蔗黑穗病菌拮抗细菌的筛选及鉴定[J]．广西农业生物科学，2004，23(3)：197～201
[40] 邱思鑫，何红，阮宏椿等．内生芽孢杆菌TB2防治辣椒疫病效果及其机理初探[J]．植物病理学报，2004．34(2)：173～179
[41] 何红，蔡学清，洪永聪．内生菌BS-2对蔬菜立枯病的抑制效果[J]．福建农林大学学报(自然科学版)，2004，33(1)：17～20
[42] Kudryashova E. B., Vinokurova N. G., Arishina E. V. Bacillus subtilis and Phenotypically Similar Strains Producing Hexaene Antibiotics[J]. Applied Biochemistry & Microbiology, 2005, 41 (5): 486～489
[43] 郝变青，马利平，乔雄梧等．芽孢杆菌BC98-Ⅰ拮抗蛋白性质及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌作用[J]．石河子大学学报(自然科学版)，2004，22(增刊)：91～94
[44] 刘晓妹，陈秀蓉，蒲金基．芽孢杆菌B_1、B_2对豌豆尖镰孢菌抗菌机理的研究[J]．微生物学通报，2004，31(3)：1～5
[45] 林呈福，李德葆．桔草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S9对植物病原真菌的溶菌作用[J]．植物病理学报，2003，33(2)：174～177
[46] 侯珲，朱建兰．桔草芽孢杆菌对番茄茎基腐病菌和葡萄灰霉病菌的抑制作用研究[J]．甘肃农业大学学报，2003，1：51～56
[47] 何红，蔡学清，关雄等．内生菌BS-2菌株的抗菌蛋白及其防病作用[J]．植物病理学报，2003，33(4)：373～378
[48] 彭好文，黎起秦，蒙姣荣等．芽孢杆菌B11拮抗蛋白性质及其对西瓜枯萎病菌的作用机理[J]．植物保护，2003，29(5)：22～25
[49] 田黎，顾振芳，陈杰等．海洋细菌B-9987菌株产生的抑菌物质及对几种植物病原真菌的作用[J]．植物病理学报，2003，33(1)：77～80
[50] 杜立新，冯书亮，曹克强等．枯草芽孢杆菌BS-208和BS-209菌株防治番茄灰霉病研究[J]．农药学学报，2004，6(3)：37～42
[51] 魏宝东，车芙蓉，马岩松．芽孢杆菌(Bacillus)发酵滤液对灰霉葡萄孢菌的作用[J]．辽宁农业科学，2004(3)：5～7
[52] 高学文，姚仕义．Huong Pham，枯草芽孢杆菌B_2菌株产生的抑菌活性物质分析[J]．中国生物防治，2003，19(4)：175～179
[53] 胨冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)对烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制作用[J]．土壤通报，2003，34(5)：452～454
[54] 田宏先，崔林，王秀英．马铃薯内生促生菌的促生长作用[J]．山西农业科学，2003，31(1)：28～30
[55] 王光华，周克琴，张秋英等．拮抗细菌BRF1对几种植物病原真菌的抗生效果[J]．中国生物防治，2003，19(2)：73～77
[56] 徐进，何礼远，冯洁等．生防细菌对马铃薯青枯病的防病增产作用研究[J]．植物保护，2003，29(5)：40～42
[57] 童蕴慧，郭桂萍，徐敬友等．拮抗细菌对番茄植株抗灰霉病的诱导[J]．中国生物防治，2004，20(3)：187～189
[58] 高芬，马利平，乔雄梧等．抗黄瓜枯萎病的芽孢杆菌BC 98-Ⅰ抗真菌物质的初步分离研究[J]．石河子大学学报(自然科学版)，2004，22(增刊)：88～90
[59] 何红，蔡学清，关雄等．辣椒内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-2和BS-1防治辣椒炭疽病研究[J]．植物病理学报，2003，33(2)：170～173
[60] 冯书亮，王容燕，林开春等．拮抗细菌BS-208菌株鉴定及对几种植物病原菌的抑菌测定[J]．中国生物防治，2003，19(4)：171～174
[61] 郭荣君，刘杏忠，杨怀文．芽孢杆菌BH1防治大豆根腐病的效果及机制[J]．中国生物防治，2003，19(4)：180～184
[62] Trejo-Estrada SR, Paszcaynski A, Crawford DL. Antibiotics and enzymes produced by the biocontrol agent Strepto myces violaceusiger TCED-9[J]. J Indust Microb Biotech, 1998, 21:81～90
[63] 陈中义，张杰，黄大肪．植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究[J]．植物病理学报，2003，33(2)：97～103
[64] 沈卫锋，张炳欣，沈立荣．大麦赤霉病菌拮抗细菌CC41的鉴定[J]．浙江农业学报，2004，16(2)：84～87
[65] 朱茂山，赵奎华，刘长远等．枯草芽孢杆菌B18菌株对黄瓜枯萎病菌抑菌作用研究[J]．辽宁农业科学，2003(3)：39
[66] 林国宪，黄勤清，董德臻等．枯草芽孢杆菌TH_2菌株抗菌物质产生的技术研究[J]．武夷科学，2003，19：23～27
[67] 刘晓妹，陈秀蓉，蒲金基．两株芽孢杆菌无菌液抗菌谱及稳定性测定[J]．中国生物防治，2003，19(3)：141～143
[68] Munekage Y, Le T X, Kato S. Antibiotic resistance in bacteria from shrimp farming in mangrove areas[J]. Science of the total environment, 2005, 10(349): 95～10
[69] Wilson C L, M. F, Wisniewski. Biological control of postharvest dieases of fruits and vegetables: an emerging technology[J]. Ann. Rev. Phytopathol, 1989, 27:525～541
[70] Magdalena S, Makoto S. The influence of Bacillus sublilis RB14-C on the development of Rhizoctonia solani and indigenous microorganisms in the soil[J]. Canadian journal of Microbiology, 2005, 5(51):405～512
[71] Kim W. G., Rajkarnikar A., Yoo T. M., et al. Biological control agent of common scab disease by antagonistic strain Bacillus sp. Sunhua[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(1): 213～221
[72] 顾真荣，吴畏，高新华等．枯草芽孢杆菌G3菌株的抗菌物质及其特性[J]．植物病理学报，2004，34(2)：166～172
[73] Tamehiro N, Okamoto Y, Okamoto S, et al. Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotc produced by Bacillus subtilis I68 [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46:315～320
[74] 刘静，王军，姚建铭等．枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化[J]．微生物学报，2004，44(4)：511～514
[75] Yoshida S, Hiradate S, Tsukamoto T, et al. Antimicrobial activity of culture filitrate of Bacillus a mylolique faciens RC-2 is olated from mulberry leaves [J]. Phytopathology, 2001, 91(2): 181～187
[76] 姚乌兰，王云山，韩继刚等．水稻生防菌株多粘类芽孢杆菌WY110抗菌蛋白的纯化及其基因克隆[J]．遗传学报，2004，31(9)：878～887
[77] 邱立友．微生物几丁质酶与害虫防治[J]．河南农业大学学报，1995，29(2)：184～191
[78] 陈红，李平，郑爱萍等．广谱抗病虫几丁质酶产生菌X_2-23的筛选与鉴定[J]．植物病理学报，2003，33(4)：368～372
[79] 曹燕鲁，吴琼，刘矫．巨大芽孢杆菌B-1301分泌物的抑菌作用及其特性的研究[J]．山东轻工业学院学报，2004，18(2)：51～55
[80] 杨胜远，陈桂光．肖功年等．芽孢杆菌Bacillus sp．X-98-2对芒果保鲜作用[J]．食品科学．2004，25(3)：180～183
[81] 谢海平，黄晖，黄登峰等．海洋枯草芽孢杆菌BS-1产生多种抗真菌活性物质[J]．中山大学学报(自然科学版)，2004，2(3)：122～123
[82] 王光华，Jos M．Raaij makers．生防细菌产生的拮抗物质及其在生物防治中的作用[J]．应用生态学报，2004，15(6)：1100～1104
[83] 谯天敏，朱天辉，李芳莲．绿粘帚霉与坚强芽孢杆菌的亲和性研究[J]．四川林业科技，2005，26(6)：5～7
[84] 谯天敏，朱天辉，李芳莲．绿粘帚霉与坚强芽孢杆菌对松赤枯病的协同生物控制[J]．林业科 技，2006，31(1)：28～31
[85] 李阜棣，胡正嘉．微生物学[M]．北京：中国农业出版社，2001，5：29，100，104
[86] Bulla L A Jr, Hoch J A. Biology of the Bacilli. In: Demain A[J]. Solomn N A. ed. Biology of industrial microorganisms, 1985:57～78
[87] Landy M, Warren GH, Roseman S B, et al. Bacillus yein. Anantibiofie from Bacillus sublilis active against pathogenicfungi[J]. Proc. Sac. Biol. Med, 1948, 67:539～541.
[88] Peypoux F, Bonmatin M, Wallach J. Recent trends in the biochemistry of stafactin[J]. Appl Mierobiol Biotechnol, 1999, 51:553～563.
[89] Vanittanakom N, Loefller W, Koch U, et al. Fengyeina novel antifungi lipopepfide antibiotic produced by Bacillus subtilis F-29-3 [J]. Anfibiot, 1986.39(7):888～901.
[90] Maget-Dana R, Peypoux F. Iturins, a special class of pore-fomling lipopeptides:bidog～cal and physicochemical properties[J]. Toxicology, 1994, 87:151～174.
[91] 梁启美，齐东梅，贾洁等．棉花黄、枯萎病拮抗菌的筛选及抗菌蛋白B_(10)-a的初步测定[J]．植物保护，2005，31(5)：25～28
[92] 刘进元，李忠，陈章良等．抗菌蛋白LCⅢ的分离纯化及其部分特性[J]．生物工程学报，1992，8(3)：266～270
[93] Handelsman J, Stabb E V, Biocontrol of soilborne plant pathogens [J]. The plant cell, 1996, 8:1855～1869
[94] Wilson C L, Chamtz E. Postharvest biological cOntrol of Penicilli rots of citrus with antagonist yeast sand bacteria[J]. Sci. Horticult, 1989, 40:105～112