摘要
新铁炮百合(Lilium formolongi)是台湾百合(L.formosanum)和麝香百合(L.Longiflorum)种间杂种，是以种子繁殖生产切花为特色。其株系间亲和性较大，又可保留种球，适合研究世代的遗传分化。本实验通过对自交株系的RAPD检测，探讨了其遗传多样性变异趋势和株系间的遗传分化。主要研究结果如下：
(1)通过优化设计，确定了新铁炮百合的RAPD反应体系和反应程序参数。
单引物反应：dNTPs 150μmol／L，Bg~(2+)1.5mmol／L，Taq聚合酶1U，引物primer 0.3μmol／L，模板DNA50ng，反应总体积为20μl。
双引物反应：dNTPs 200μmol／L，Mg~(2+)2mmol／L，Taq聚合酶1.5U，引物primer 0.4μmol／L，模板DNA50ng，反应总体积为20μl。双引物的最佳反应成分浓度普遍比单引物的要高。
反应程序参数：(1)94℃预变性5min 1个循环；(2)94℃变性30sec，37℃退火50sec，72℃延伸1min，35个循环；(3)72℃延伸10min 1个循环；(4)4℃保存，待用。
(2)采用正交设计的极差法得出影响RAPD实验因素的大小顺序：①反应条件因素显著性程度依次为：Mg~(2+)＞primer＞Taq＞dNTPs＞DNA；②反应参数因素显著性程度依次为：循环次数＞
延伸时间＞复性温度＞复性时间。
门门 条单引物和 8个双引物用于新铁炮百合的 RAPD扩
增，产生扩增总谱带达 198条，163条谱带是多态的，多态百
分比达 引．8兄 双引物谱带的产生和单引物的谱带无必然关
系。双引物可以扩增出单引物所没有的DNA片段，但也可能会
连单引物的谱带也扩增不出来。
（4）用多态性百分率、相对多态性频度和 Shannon 遗传
多样性指数评价世代间的遗传多样性变化。其中引物 SIg、
5303＋S 366＼519＋5210、5469＋519、555＋530白 多态百分比 均
为 100儿 羡现极高的多态性。F。世代、F。世代、F。世代多态性
百分比分别为 5 9．1趴 5 6．6兄 4 8．0队 多态性百分比呈现出下
＊ 白 趋势。
三个世代的 遗传多样性主 数分别为：1．749、1．530、1．292，
也是呈现下降的趋势。在总变异中，群体内和群体间遗传多样
性所占的比率分别为 76．2％和 23．8儿羡现出群体内大于群体
间的趋势，这与新铁炮百合的繁育系统相符合的。
门）通过非加权算术平均数对群聚类法 uPGMA）构建品
系间的系统聚类树。从三个数据集获得的聚类结果可以看出，
其聚类树状图基本反应系谱关系：双引物扩增结果能较精确反
应其系谱关系。在亲缘关系相近的品系，用RAPD方法能比较
准确地推测到世代间的遗传多样性、遗传分化的细小变化。
Lilium formolongi was an interspecific hybridization between Lilium formosanum and Lilium Longiflorum with the characteristics of producing cut-flower by seedlings. For strong compatibility between lines and preservable bulbs, Lilium formolongi was a good material for genetic diversity and genetic differentiation analysis. The trend of genetic diversity and genetic differentiation of selfed lines was studied based on RAPD markers. The results could be summarized as follows.
1. By optimal experimental design, the conditions of RAPD were confirmed as follows.
Single primer reaction: dNTPsl50 mol/L, Mg2+1.5mmol/L,Taq polymerase 1U, primer0.3 mol/L,DNA template 50ng,total volume 20 u 1 .
Double prime reaction: dNTPs200 u mol/L, Mg2+2mmol/L, Taq polymerasel.5U, primer0.4 mol/L, DNA template 50ng, total volume 20 1 Concentrations of double primer were higher than those of single primer, except that of DNA template, for best effect.
Reaction procedure parameters: (1)pre-denatured DNA at 94 C for 5 min,1 cycle; (2) denatured DNA 94 C for 30sec,annealed primer at 37C for 50sec,extended primers at 72 C for 1min ,35 cycles; (3)re-extended reaction at 72 C for 10min,l cycle; (4) Stored product at 4 C.
2. A total of 163 polymorphic bands out of 198 reproducible
products were amplified from the selected 11 single primers and 8 double primers, corresponding to 81.8% polymorphism of the amplification bands. The bands generated by double primer had no obvious relationship with single primer. The bands generated by single primer had no relation with double primer either.
3. To evaluate genetic diversity of generations, percentage of polymorphic bands, Shannon genetic diversity index and relative polymorphism frequency were studied. The percentage of polymorphic bands of primer S19, S303+S1366, S19+S210, S469+S19, S55+S30 were 100%. The percentage of polymorphic bands of F2, F3, F4 generations were 59.1%, 56.6%, 48.0% respectively, which showed reduction trend.
4. The genetic diversities of three generations were 1.749, 1.530, 1.292, which also showed reduction trend. Among total variation, genetic diversity intrapopulation accounted for 76.2%, interpopulation for 23.8%. This result showed that genetic diversity of intrapopulations was higher than that of interpopulations.
5. UPGMA cluster analysis could reveal original strain relationships. The data set from double primers revealed more accurately. RAPD markers could accurately reveal small change of genetic diversity and genetic differentiation among near genetic relationship.
引文
1.TUYL JMV,DIEN MPV,CREIJ MGMV,et al.Application of in vitro pollination,ovary culture ,ovuleculture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses [J].Plant Sci Limerick, 1991,74(1): 115～126.
2.KIMKW,SLINGSK.Obtaining plantlets through immature embryo culture of lilies[J].Korean Soc Holt Sci,1990,31(4):423～431.
3.FEMANDEZ I S,NAKAZAKI T ,TANISAKA T. Development of diploid and triploid interspecific hybrids between Lilium longifiorum and L.concoIor by ovary slice culture[J].Plant Breed ,1996,115(3):167～171.
4.ROHMS,GRIESBACH R J,LAWSON R H ,et al.Evaluation of interspecific hybrids of Lilium longiflorum and L.Xelegans[J].ActaHort, 1996,414:93～110.
5.TUYL J M V, DIJKEN A V ,CHI H S, et al. Breakthroughs in interspecific hybridization of lily [J].ActaHort, 2000,508:83～90.
6.WATAD A A,YUN D J,MATSUMOTO T ,et al. Microprojectile bombardment-mediated transformation of Lilium longifiorum [J].Plant Cell Rep, 1997,17(4):262～267.
7．赵祥云，王树栋，陈新露，等．中国百合二十年进展[M]．中国花卉科技二十年，中国林业出版社．2000：515～525．
8．赵桦，张羽．二种百合科植物染色体纠型分析[J]．汉中师范学院学报，1996，1：55～59．
9．张西丽，周厚高，周焱，等．百合品种间的数量分类[J]．研究广西植物，2000，20(4)：325～328．
10．周厚高，张西丽，王中仁，等．几个百合品种遗传亲缘关系的等位酶分析用．西南农业学报，1999，12(4)：92～95．
11．周厚高，周焱，宁云芬，等．新铁炮百合自交初代遗传结构与分化的研究[J]．仲恺农业技术学院学报，2001，14(3)：1～7．
12．黄济明．王百合与大卫百合种间远缘杂种的育成[J]．园艺学报，1982，3(9)：51～55．
13．黄济明，赵小艺，张国民，等．玫红百合为父本育成百合种间杂种[J]，园艺学报，1990，2(17)：7～10．
14．彭隆金．百合科杂交研究，植物引种驯化集刊，1993，(8)：99～107．
15．杨利平，丁冰，等．条叶百合×王百合种间杂种的育成[J]．东北林业大学学报，1998，(28)：35～40．
16．范小峰，郭小强，李师翁．子午岭产4种百合科植物的核刑多样性研究[J]．西北植物学报 2000，20(5)：882～888．
17．朱学南，金孝锋，高瞻．白合科三种植物的核型分析[J]．浙江林业科技，2002，22(2)：22～25．
18．刘选明，周朴华，卢向阳，等．四倍体百合体细胞形态发生中三种同工酶谱变化的研究[J]．湖南农业大学学报，1996，22(2)：106～112，
19．周厚高，周焱，宁云芬，王凤兰，等．新铁炮百合白交初代遗传分化的等位酶分析[J]．遗传学报，2002，29(1)：72～78．
20．Clark MS主编，顾红雅，瞿礼嘉主译，植物分子生物学—实验手册．高等教育出版社 1998：43．
21.WILLIAMS J G K, DUBELIK A R, LIVAK K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18:6 53 1～6 535.
22.WELSH J, MCCLELLAND M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J]. Nucleic Acids Res, 1990,18:7213～7219.
23.Caetano Anolles G, 1991.Bio technology,9:553～557.
24．沈法富，于元杰，尹承佾．小麦以引物RAPD分析方法的研究[J]．西北植物学报，1998，18(3)：428～432．
25．莫结胜，刘杰，刘公社，等．杂交油葵A15种子纯度的RAPD鉴定[J]．作物学报，2001，27(01)：85～90．
26．李培金，朱苏文，程备久，等．玉米RAPD分析影响因素的研究[J]．安徽农业大学学报(自然科学版)，2000，27(03)：254～257．
27．李子银，林兴华，谢岳峰，等，利用分子标记定位农垦585的光敏核不育基因[J]，植物学报，1999，41(7)：731～735．
28．邹继军，董伟，张志永，等．大豆RAPD影响因素的探讨[J]．大豆科学，1998，17(3)：197～
201．
29．左开井，孙济中，张金发，等．棉花RAPD分析条件优化探讨[J]．棉花学报，1997，9(6)：304～307．
30．魏伟，王洪新，胡志昂，等．毛乌素沙地柠条群体分子生态学初步研究[J]．生态学报，1999，19(1)：16～22
31．汪小全，邹喻苹，张大明，等．银杉遗传多样性的RAPD分析[J]．中国科学(C辑)，1996，26(5)：43 6～44．
32．李春香，杨群，周建平．水杉自然居群遗传多样性的RAPD研究[J]．中山大学学报(自然科学版)，1999，38(1)：59～63．
33．赵桂仿，Francois Felber Philippe Kuepfer.应用RAPD技术研究阿尔卑斯山黄花茅居群内的遗传分化[J]，植物分类学报，2000，38(1)：64～70．
34．李建民，周志春，吴开云，等．RAPD标记研究马褂木地理种群的遗传分化[J]．林业科学，2002，38(4)：61～66．
35．朱青竹，赵国忠，赵丽芬．不同来源棉花种质资源基于RAPD的遗传变异[J]．河北农业大学学报，2002，25(04)：16～33．
36．解新明，云锦凤，尹俊，等．蒙古冰草遗传多样性的RAPD分析[J]．西北植物学报，2002，22(1)：56～62．
37．戴思兰．中国栽培菊花起源的综合研究[D]．北京林业大学博大学位论文，1994．
38．陈亮，山口聪，王平盛，等．利用RAPD进行茶组植物遗传多样性和分子系统学分析[J]．茶叶科学，2002，22(1)：19～24．
39．陈向明，郑国生，孟丽．玫瑰、月季、蔷薇等蔷薇属植物RAPD分析[J]．园艺学报，2002，29(1)：78～80．
40．张太平，彭少麟，王峥峰，等．柚类品种遗传相互关系的RAPD标记研究[J]．热带亚热带植物学报，2001，9(04)：22～29．
41．高明刚，杨克诚，张怀渝．四川部分玉米强优势组合及其亲本自交系的RAPD分析[J]．四川农业大学学报，2002，20(2)：96～99．
42．王茅雁，张海明，李德军，等．RAPD在油用向日葵自交系鉴定和遗传分析中的应用[J]，内蒙古农业大学学报(自然科学版)，2001，22(02)：52～55．
43．吴敏生，戴景瑞．中国17个优良玉米自交系的分子标记杂合性及其与杂交种性状的关系研究[J]．西北植物学报，2000，20(5)：691～700．
44．袁力行，傅骏骅，Warburton M．利用RFLP、SSR、AFLP和RAPD标记分析玉米自交系遗传多样性的比较研究[J]，遗传学报，2000，27(08)：725～733．
45．赵久然，郭景伦，郭强．应用RAPD分子标记技术对我国骨干玉米自交系进行类群划分[J]．华北农学报，1999，7(2)：12～15．
46．孙致良，张超良，金德敏，等．RAPD技术在玉米自交系亲缘关系研究中的应用[J]．遗传学报，1999，26(1)：61～68．
47．赵久然，郭景伦，孔艳芳，等．应用RAPD分子标记技术选配强优势玉米杂交纠合的研究[J]．玉米科学，1999，7(2)：12～15．
48．彭泽斌，刘新芝，等．玉米自交系杂种优势类群与杂优模式构建的初步研究[J]．作物学报，1998，24(6)：709～717．
49．吴敏生，王守才，戴景瑞．RAPD分子标记与玉米杂种产量优势预测的研究[J]．遗传学报，1999，26(5)：578～584．
50．胡英考，辛志勇．小麦合成种M53抗白粉病基因的RAPD和SSR标记[J]．作物学报，2001，27(4)：415～419．
51.Liu Z,Sun Q,et al.plant Breeding, 1999, 118(3):215～219.
52.Miklas P N ,Larsen R C ,et al. Euphytica, 2000,116 (3):211～219.
53.Barloy D,Le monine J,et al. Plant Breeding, 2000, 119(2) :169～172.
54．索广力，黄古景，何聪芬，等．利用RAPD-BSA技术筛选小麦耐盐突变位点的分子标记[J]．植物学报，2001，43(6)：598～602．
55．潘新法，盂祥勋，曹广力，等．RAPD在枇杷品种鉴定中的应用[J]．果树学报，2002，19(2)：136～138．
56．林同香，陈振光，戴思兰，等．RAPD技术在龙眼品种分类中的应用[J]．植物学报，1998，40(12)：1159～1165．
57.Torres A M,Millan T,Cubero J Ⅰ.ldentifying rose cltivars using random amplified polymorphic DNA markers[J].Hor Science, 1998,28(4):333～334.
58.Mailer R J.Discrimination among cultivars of rapeseed (BrassicanapusL.) using DNA
polymorphisms amplified from arbitrary primers[J].Theor. Appl.Genet.1994,87:697～704.
59．杜道林，苏杰，周鹏，郑学勤，等．香蕉33个品种的RAPD研究[J]．植物学报，2001，43(10)：1036～1042．
60.LEE W B,CHOlSY,KIMYS .An application of random amplified polymorphic DNA (RAPD) to systematics of some species of Lilium in Korea [J].Korean Journal of Plant Taxonomy ,1993,23 (2) :35～42.
61.YAMAGISHI M.Detection of section specific random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in Lilium [J].Theor and Appl Genet, 1995,91 (6-7):830～835.
62.PERSSON H A ,LUNDQUIS T K ,NYBOM H.RAPD analysis of genetic variation within and among populations of Turk's cap-lily (Lilium martagon L.) [J].Hereditas ,1998. 12 8(3):213～220.
63.WEN C S,HIS AOJY.Genetic differentiation of Lilium longiflorum Thunb.var. Scabrum Masam. (Liliaceae) inTaiwan using random amplified polymorphic DNA and morphological characters [J]. Bot Bull Acad Sinica,1999,40 (1):65～71.
64.MUtSERS J J M ,VAN O J C ,VAN T J M, et al.Molecular markers as a tool for breeding for flower longevity in Asiatic hybrid lilies [J].Acta Hort, 1995,420:68～71.
65.Straathof Th.P. et al. Genetic analysis of inheritance of partial resistance to Fusuatium oxysprum in lily using RAPD marker.(Abstract),lnt.Sym.Genus LILIUM, 1994:10.
66.Lee J.S. Lim. Y.P. Classification of lilies using random amplified polymorphic DNA(RAPD) analysis,(Abstract) Int. Sym. Genus LILIUM, 1994:10.
67．赵祥云，陈新露，方海，等．用RAPD标记评价百合品种间遗传关系[J]．北京农学院学报，1995，10(2)：58～63．
68.Couch JA,Fritz PJ(1990) Isolation of DNA from plants high in polyphenolics. Plant Mol Biol Rep8(1):8～12.
69．邹喻苹，葛颂，王晓东，等．系统与进化植物学中的分子标记[M]．科学出版社 2001，27．
70.Lutz,C.T. 1989.A Laboratory Manual of Molecular Biology. Department of Pathology. University of Iowa.,Iowa City, IA 52242.
71．汪小全，邹喻苹，张大明，等．RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题[J]．植物学
报，1996，38(12)：954～962．
72.Belaj A,Trujilo I,Rosa R,et al.Polymorphism and discrimination capacity of random amplified polymorphic markers in an olive germplsm[J].Amer Soc Hort Sci, 2001, 126 (1):64～71.
73.Nei M. Genetics, 1978, 89:583～590.
74.Armstrong J,Gibbs A, Peakall R et al.RAPDistance Programs;Version 1.04 for the analysis of patterns of RAPD fragments.Caberra :Australian National University. 1996.
75.Nei, M. and Li, W.H. (1979). Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5269～5273.
76．何正文，刘运生，陈立华，等．正交设计直观分析法优化PCR条件[J]．湖南医科大学学报， 1998，2 3(4)：403～404．
77．石磊，王学仁，孙文爽编著．试验设计基础[M]．重庆大学出版社，1997，2：189～195
78.Wilkie S E,Isaac P G,Slater R J. Random amplified polymorphic DNA(RAPD) markers for enetic analysis in Allium. Theor Appl Genet, 1993.86:497～504.
79.Roy A,Frascaria N,Mackay J.Segregating random amplifed polymorphic DNAs in Betula alleghaniensis.Theor Appl Genet, 1992,85:173～180.
80．赵姝华，张波．RAPD标记技术的实用性及稳定性探讨[J]．国外农学—杂粮作物，1999，19(4)：13～15．
81.Hamrick J L,Godt M J W.1990.Allozyme diversity in plant species.In:Brown A H D,Clegg M T, Kahler A L.et al.Ed. Plant population genetic resources.Sunderland ,Mass: Sinauer,43 63.
82．钱迎倩，马克平(主编)生物多样性研究的方法和原理．北京：中国科学技术出版社，1995：122～140．
83.Dawson I K ,Chalmers K J,Waugh R and Powell W. 1993.Detection and analysis of genetic variation in Hordeum spontaneum populations from Israel using RAPD markers.Molecular Ecology2:151～159.
84．师丽华，杨光耀，林新春，等．毛竹种下等级的RAPD研究[J]．南京林业大学学报(自然科学版)，2002，2 6(3)：65～68．
85．李周岐，王章荣 杂种马褂木无性系随机扩增多态DNA指纹图谱的构建[J]．东北林业大学
学报，2001，29(04)：5～8．
86．翁尧富，陈源，赵勇春，等。板栗优良品种(无性系)苗木分子标记鉴别研究[J]．林业科学，2001，37(02)：51～55．
87．林凤，杨立国，王富德，等RAPD分子标记在玉米自交系种群关系研究中的应用[J]．杂粮作物 1999，19(1)：1～4．