摘要
目的:从细胞层面探讨三邻甲苯基磷酸酯(TOCP)的神经毒性作用机制。方法:采用人成神经瘤母细胞SH-SY5Y为模型,全反式维甲酸诱导细胞分化,不同浓度的TOCP染毒未分化与分化的SH-SY5Y细胞6~72 h,荧光分光光度计法测calpain活性、20S proteasome和26S proteasome的活性;采用钙通道阻滞剂20μM verapamil和100μM 2-APB预处理细胞15min后染毒1.0 mM TOCP 48h,荧光分光光度计法测calpain活性,western blot检测LC3II/I表达;不同浓度TOCP染毒SH-SY5Y细胞48h,western blot检测微管相关蛋白MAP-2、泛素结合蛋白p62和泛素化蛋白表达等。结果:(1)与对照组比较,TOCP处理后细胞内的calpain活性增高(P<0.05),26S proteasome的T-L活性降低(P<0.01),并呈现明显的剂量效应和时间效应关系,分化后的细胞calpain活性升高更明显(P<0.01);与1.0mM TOCP组比较,verapamil预处理组和2-APB预处理组细胞calpain活性均降低(P<0.05),verapamil+2-APB预处理组calpain活性降低更明显(P<0.05),分化后的细胞经钙阻滞剂预处理后calpain活性降低更明显(P<0.01)。(2)westem blot检测结果显示:与对照组组比较,verapamil预处理组LC3 II/I比值无变化(P>0.05),与1.0 mM TOCP处理组比较,LC3 II/I比值升高(P<0.05);而2-APB预处理组与对照组组比较,LC3 II/I比值明显升高(P<0.05),与1.0mMTOCP组比较,LC3 II/I比值降低(P>0.05)。(3)不同浓度TOCP染毒48h后,MAP-2蛋白表达降低,呈剂量依赖趋势(P<0.05),p62蛋白表达呈降低趋势(P<0.05),高分子量蛋白的泛素化水平增加,1.0 mM TOCP染毒48h最为明显(P<0.05)。结论:TOCP能诱发SH-SY5Y细胞白噬,钙信号紊乱是TOCP诱发自噬的原因之一;TOCP能抑制泛素蛋白酶体系统,诱发自噬。
引文